畜肉及内脏中肾上腺素、3,4-二羟基扁桃酸、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸的测定（BJS202109）解读

　　中国肉类食品综合研究中心在食品安全监测中发现，一些不法企业在给猪注水的同时还会注射肾上腺素、异丙嗪等药物。近年来，我国也查获了与注射肾上腺素相关的动物非法注水案件，此类非法注水行为严重危害了消费者的健康及财产安全。
　　肾上腺素。盐酸肾上腺素作为兽用处方药主要用于动物心脏骤停的急救，还可用于缓解严重过敏性疾患的症状，与局部麻醉药配伍以延长麻醉持续时间等。肾上腺素是一种强烈的β-受体激动剂，可以加快生猪对水分的吸收，同时肾上腺素还是一种强烈的α-受体激动剂，可使皮肤、黏膜血管和肾脏血管强烈收缩，阻碍生猪对水分的排泄。因此，一些不法屠宰经营者为追求经济利益，将肾上腺素非法用于畜类宰前注水，达到保水增重目的。通过检测动物体内肾上腺素等保水药物的异常含量来判定非法注水现象，是一种有效的“注水肉”判别方式。
　　代谢产物。肾上腺素口服吸收率低，临床上一般采用皮下注射的方式给药，3~ 5 min显效。注射给药后，其会迅速被血液和组织中的儿茶酚-O-甲基转移酶和单胺氧化酶代谢失活，转化成代谢物3,4-二羟基扁桃酸、甲氧基肾上腺素和4-羟基-3-甲氧基扁桃酸等，4-羟基-3-甲氧基扁桃酸为最终代谢产物，最后经尿液排出体外。经研究，甲氧基肾上腺素在代谢过程中极不稳定，会迅速转化为4-羟基-3-甲氧基扁桃酸，在动物体内存在时间短、含量低，因此不适宜作为检测目标物。综上所述，实际样品检测中除了测定原药肾上腺素外，本方法还关注了其代谢产物3,4-二羟基扁桃酸和4-羟基-3-甲氧基扁桃酸。

方法原理
　　肾上腺素是一种含有儿茶酚和胺基的物质，含有一个双羟基苯核和一个带氨基的侧链，在ESI（电喷雾电离）离子化过程中易得到质子，形成[M+H]+信号峰，因此选取ESI+
　　模式检测；3,4-二羟基扁桃酸和4-羟基-3-甲氧基扁桃酸的分子结构中均含有酚羟基，在ESI（电喷雾电离）离子化过程中易丢失质子，形成[M-H]-信号峰，因此选取ESI-
　　模式检测。
　　文献报道的肾上腺素及代谢物的检测多针对尿液、血液等样本，相较于此类样本，肉类食品样本基质更为复杂，检测结果更容易受到样品的干扰，影响方法的准确度及灵敏度。在之前的研究中，多采用高效液相色谱-电化学法检测样品中的肾上腺素及代谢物，但该方法存在前处理过程复杂、检测时间长、准确定性难等问题。为解决上述技术问题，本方法采用甲酸-乙腈溶液提取，经填料为反相混合型N-乙烯吡咯烷酮二乙烯基苯聚合物的固相萃取柱净化后，用液相色谱串联质谱法对其进行测定。

操作要点
　　1.标准溶液的配制。在配制肾上腺素及肾上腺素-d3标准储备液时，应加入0.1 moL/L的盐酸使其完全溶解。
　　2.提取溶剂的选择。肾上腺素、3,4-二羟基扁桃酸、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸属于极性化合物，根据相似相溶原理，并参考国内外相关文献，选择提取溶液。对比了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、0.1%高氯酸溶液、甲酸-乙腈溶液、乙腈溶液作为提取溶剂的回收率。结果表明：甲酸-乙腈溶液作为提取溶液时，肾上腺素、4-羟基-3-甲氧基扁桃酸、3,4-二羟基扁桃酸三种物质的回收率都较高。
　　3.提取方式的选择。在提取方式上，比较了振荡、均质及超声三种提取方式对肾上腺素等三种目标化合物的提取效率，研究结果表明，振荡提取过程较为温和，无法使目标化合物被充分提取；均质提取虽然能够使目标化合物被充分提取，但是由于样品均质后基质抑制效应明显增强，降低了方法的灵敏度及回收率，因此选用超声20min作为提取条件。
　　4.净化方式的选择。样品在提取过程中虽会去除大部分的脂肪、蛋白等干扰物质，但提取溶液中仍含有大量的杂质，会在后续的检测过程中产生明显的基质效应，对于基质效应严重的目标化合物还需进一步净化。相较于液液萃取等净化方式，固相萃取柱（SPE）的净化方式可以有效保留目标物，除掉多余杂质，而且操作快捷，因此选取固相萃取柱对其进行进一步富集、除杂。填料为反相混合型N-乙烯吡咯烷酮二乙烯基苯聚合物的固相萃取柱可以有效去除样品中的脂肪及蛋白质，能够明显减低基质效应。
　　5.氮吹温度的选择。根据肾上腺素及代谢物具有易降解的特性，为防止其降解，不适宜选择较高的氮吹温度，分别考察了氮吹温度为25℃、30℃、40℃及50℃时肾上腺素及代谢物的回收率情况，研究表明当氮吹温度为50℃时，肾上腺素及代谢物回收率均有所降低，其中3,4-二羟基扁桃酸的回收率降低较多，当氮吹温度低于40℃时，对回收率的影响不大，因此要求氮吹温度低于40℃。
　　6.基质效应。通过绘制溶剂标准曲线和基质匹配标准曲线，按照[(基质匹配标准曲线的斜率-溶剂标准曲线的斜率）/溶剂标准曲线的斜率]×100%来评价基质效应。经验证，实际样品中肾上腺素及代谢物均呈现强基质作用，需要采用内标来校正基质效应的影响。

□中国肉类食品综合研究中心　赵文涛 王 妍