食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定

　　苯甲酸钠、山梨酸钾及糖精钠作为食品添加剂，在食品生产加工环节应用较为广泛。该类指标在日常抽检监测中也常会涉及，覆盖品种多，也常有不合格信息发布。检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的食品安全国家标准为GB 5009.28-2016，标准于2017年6月23日开始正式实施，方法包括液相色谱法和气相色谱法，但方法涉及基质多，样品前处理也无净化步骤，在检验中如积累经验不足或不熟悉各操作要点，可能会出现误判或漏判风险。因此，本次主要解读该方法的适用范围、基本原理、操作注意事项及结果判定注意问题。
标准适用范围
　　标准规定了食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠测定的方法。第一法（液相色谱法）适用于食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定；第二法（气相色谱法）适用于酱油、水果汁、果酱中苯甲酸、山梨酸的测定。第一法和第二法适用范围有所差异。
基本原理
　　第一法（液相色谱法）：样品经水提取，高脂肪样品经正己烷脱脂、高蛋白样品经蛋白沉淀剂沉淀蛋白，采用液相色谱分离、紫外检测器检测，外标法定量。
　　第二法（气相色谱法）：试样经盐酸酸化后，用乙醚提取苯甲酸、山梨酸，采用气相色谱-氢火焰离子化检测器进行分离测定，外标法定量。
操作注意事项
　　试样制备
　　试样制备前要注意检验样品、复检样品的包装个数和总量是否满足标准要求。样品均匀性对指标检测起着至关重要的作用，样品制备需取多个预包装的饮料、液态奶等均匀样品直接混合；依据标准处理一些特殊样品，通过加热熔融等方式；带壳熟制坚果与籽类测定时，要注意带壳制样，这和其他类别指标，如元素、真菌毒素等有所差异。另外，熟猪蹄类样品或带果核类蜜饯样品，依据GB 2760标准的基本原则，建议可去骨或去果核制样，但计算含量时需要代入计算。
　　标准储备液制备
　　一是注意苯甲酸、山梨酸的类型，若是苯甲酸钠、山梨酸钾，用水溶解，若使用苯甲酸、山梨酸标注品时，应使用甲醇溶解。二是注意糖精钠含结晶水，标准要求使用前需在120℃烘4h，干燥器中冷却至室温后备用。三是结果计算时，要注意表示形式，可能是糖精钠表示，也可能是含结晶水形式表示，但最后出具结果时，要换算成糖精计，要做好标准溶液不同储存条件下的稳定性的期间核查。
　　供试品溶液制备
　　样品前处理，要注意一是无论加水超声（液相色谱法）还是酸化浸提（气相色谱法），最为关键的是充分振摇保证样品充分浸润，避免样品结块导致提取效果不佳，二次提取时更要注意。二是加完乙亚铁氰化钾、乙酸锌蛋白沉淀剂后，最好使劲震摇放置，保证充分沉淀。三是对一些特殊基质，依据标准要加热溶解试样或先脱除油脂等处理。
　　仪器分析系统
　　分析系统流动相是甲醇：乙酸铵溶液=5+ 95，检测波长为230nm。特别要注意备注说明，当存在干扰峰或需要辅助定性时，可以采用加入甲酸的流动相来测定，如流动相：甲醇+甲酸-乙酸铵溶液=8+92，常见分析系统可能存在以下情况：
　　一是保留时间漂移情况。苯甲酸、山梨酸等3种食品添加剂都属于离子型有机化合物，反相色谱中该类化合物的色谱行为与其平衡常数（pKa）和流动相pH值密切相关。检测中出现的常见问题是苯甲酸、山梨酸有时会出现和供试品溶液的色谱峰保留时间漂移的情况，若本身是阳性样品，如果不开展供试品中加标试验，有时会观察不到该现象，造成漏判情况；而糖精钠的色谱峰保留时间基本不变。分析原因是因为，糖精钠的平衡常数（pKa）为2.0，只要pH≥3.0时，糖精钠分子主要以解离形态（阴离子）存在，而苯甲酸、山梨酸的pKa值为4.2、4.2和5.3，当流动相pH即使发生较小变化时，保留时间就会发生变化。而目前标准中出现的情况是样品中加了蛋白沉淀剂，和标准品溶液的介质环境有所差异，流动相稍微的变化就可能因为色谱柱等情况而造成保留时间漂移情况。为解决该问题，依据积累的经验，建议在标准工作溶液中也可加入相当比例的沉淀剂，尽量保持供试品溶液和标准品溶液一致。另外，一定要通过样品中加标回收来考察识别。
　　二是色谱中可能的其他杂质干扰。食品成分越复杂，共存干扰物质就越多，如肉制品，若用较短的色谱柱，如柱长为100mm或150mm，可能山梨酸色谱峰位置会出现杂质峰包裹或临近出峰，导致干扰而不好定性的情况。归纳发现，乳制品、热加工产品或其他发生美拉德反应的产品等，易于出现干扰情况；蜜饯中山梨酸位置会出现疑似为5-羟甲基糠醛的干扰；奶茶糖精钠色谱峰位置有干扰情况。还有文献报道酒、雪糕等基质检测中，有来源于糠醛、糠醇、糠氨酸、马尿酸等干扰。
　　三是可能共存的其他添加剂的干扰。依据日常工作或相关文献报道，食品中共存添加剂也会对目标添加剂检测产生干扰，如，脱氢乙酸可能会干扰糖精钠，安赛蜜可能会干扰苯甲酸盐。因此，实验开展时，需要结合产品标签信息或检出情况进行综合判定。
　　四是如何解决上述保留时间漂移或干扰问题。建议一方面一定注意实验中进行加标回收来进行评价验证；另一方面，采用DAD光谱图来进行识别是否可能存在干扰。建议不要为提高检验效率而使用短色谱柱，最好使用长一点的色谱柱。最为关键的是要识别出有干扰或漏判情况。如确实出现干扰，可参照标准中备注要求，采用加甲酸的流动相来加强色谱分离，必要情况下也可加大水相比例或通过更换不同色谱柱，或采用不同方法，如采用气相色谱法进行交叉验证。如发现基质中有干扰，且出现系统的情况，建议可通过光谱吸收情况采用标准品进行筛选验证，也可采用质谱进行进一步确证，关键是要找出可能的干扰信息，避免出现系统性风险。
结果判定注意问题
　　苯甲酸、山梨酸、糖精钠的判定除要注意GB 2760的一些基本原则，如食品分类、防腐剂比例之和、表A.3、带入、本底、新增补通告等基本原则外，还要特别注意苯甲酸在很多食品中存在本底，如蔓越莓、干大枣、豆豉、乳制品、含乳饮料、黄酒、葡萄酒、花椒、蜂蜜等，还要注意其他浆果类等也可能存在，需要进一步积累和证实。

□四川省食品检验研究院　余晓琴 刘议蔧