食品中脱氢乙酸的测定

　　脱氢乙酸（DHA）及其钠盐（DHA-S）为我国、美国、日本批准使用的食品添加剂（防腐剂）。DHA或称α，γ-二乙酰基乙酰乙酸，固态呈白色或淡黄色结晶粉末，无臭、无味，微溶于水，水溶液呈弱酸性，易溶于碱、丙酮、苯、乙醚和甲醇，是一种活泼不稳定和可燃的化合物。DHA-S或称3-（1-羟基亚乙基）-6-甲基-1，2-吡喃- 2，4（3H）-二酮钠，呈白色或近白色结晶性粉末状，无臭、无味，易溶于水、丙二醇及甘油和甲醇，但不溶于大多数有机溶剂，其水溶液呈中性或微碱性。脱氢乙酸是广谱性的食品防腐剂，尤其对霉菌和酵母的抑菌能力强。该指标在日常抽检监测中也常涉及，覆盖品种多，汇总近些年来全国各地食品安全监督抽检结果，脱氢乙酸及其钠盐不合格情况常涉及糕点、米粉制品、生湿面制品、调味品、熟肉制品、饮料、饼干、蔬菜制品、豆制品、水果制品等食品品种，可能为超范围、超限量使用，也有防腐剂比例之和超标的情况。检测脱氢乙酸的食品安全国家标准为GB 5009.282016，于2017年3月1日开始正式实施，方法包括液相色谱法和气相色谱法。结合日常检测工作，该指标操作要点较多，需引起关注。本次主要解读方法的适用范围、基本原理、操作注意事项及结果判定注意点。
标准适用范围
　　标准适用于果蔬汁、果蔬浆、酱菜、发酵豆制品、黄油、面包、糕点、烘烤食品馅料、复合调味料、预制肉制品及熟肉制品中脱氢乙酸含量的测定，其他食品可参考执行。该指标涉及基质较多，需要做好方法适应性的确认。
基本原理
　　第一法（气相色谱法）：固体（半固体）样品，沉降蛋白、经脱脂酸化后,用乙酸乙酯提取；果蔬汁、果蔬浆样品经酸化后，用乙酸乙酯提取；用配氢火焰离子化检测器的气相色谱仪分离测定，以色谱峰的保留时间定性，外标法定量。
　　第二法（液相色谱法）：用氢氧化钠溶液提取试样中的脱氢乙酸，经脱脂、去蛋白处理，过膜，用配紫外或二极管阵列检测器的高效液相色谱仪测定，以色谱峰的保留时间定性，外标法定量。
操作注意事项
　　试样制备。样品均匀性对指标检测起着至关重要的作用，样品制备需取多个预包装的饮料、液态奶等均匀样品直接混合；要注意特殊样品的处理，如测定带壳熟制坚果与籽类时，需带壳制样，这和其他类别指标（重金属元素、真菌毒素）等有所差异；猪蹄类样品或带果核类蜜饯样品，依据GB 2760标准的基本原则，建议可去骨或去果核制样，但计算含量时需要代入计算。另外，制备后的样品中目标物可能不稳定，建议实验室可模拟考察食品基质及制备后的样品中脱氢乙酸的稳定性，便于各类基质样品制备的储存条件和检验时段等要求的制定。
　　标准储备液制备。要注意考察脱氢乙酸标准品溶液的储存稳定性，可做好不同储存条件下的稳定性的期间核查。气相色谱中的脱氢乙酸标准溶液应使用乙酸乙酯作为介质；液相色谱使用氢氧化钠溶液溶解后，用水稀释定容使用。
　　供试品溶液制备。样品前处理时，一是注意充分振摇保证样品充分浸润，避免样品结块导致提取效果不佳。二是提取时pH值调节至7.5确保脱氢乙酸在水中的溶解度，该步骤对回收率高低起着关键作用。三是要注意加完硫酸锌蛋白沉淀剂，使劲震摇放置，保证充分沉淀。四是注意一些特殊基质，如面包、糕点、焙烤食品馅料、复合调味料、黄油等，若高效液相色谱分离效果不理想，还可采用C18固相萃取柱进一步净化处理分析。
　　仪器分析系统。无论是气相色谱法还是液相色谱法，脱氢乙酸自身的烯醇式结构特性，决定了一些常见的问题：
　　一是色谱峰拖尾和保留时间漂移情况。气相或液相色谱可能都会遇到该情况，为解决该问题，依据积累的经验，气相色谱柱的选择与系统平衡尤为重要，建议气相色谱可使用非极性色谱柱或中等极性色谱柱进行分离，可通过供试品溶液中加标回收考察识别。而液相色谱中因脱氢乙酸属于非羧基酸类，在中性或碱性环境下，因为结构中存在C=O双键的共轭稳定作用，所以使其中一个C=O烯醇互变为C-O-的结构，和色谱柱填料表面未键合的硅羟基残基产生强的次级保留，使得峰形变形严重，保留时间漂移。相关文献显示，通过调节缓冲盐pH（调酸或调碱）和有机相比例可以在一定程度上抑制脱氢乙酸的拖尾。但目前行业内解决这个问题的办法是采用封尾色谱柱，让填料表面未键合硅羟基大部分被屏蔽，把次级保留效应降到更低，从而获得对称的峰形、稳定的保留时间。
　　二是脱氢乙酸色谱中可能存在的干扰问题。食品成分越复杂，共存干扰物质就越多。液相色谱一般建议使用长色谱柱和DAD光谱图识别，有文献报道共存糖精钠添加剂可能会对脱氢乙酸色谱峰有干扰，实验开展时，需要结合产品标签信息或检出情况综合判定。气相色谱法可采用程序升温等优化条件来改进。
　　如何解决上述保留时间漂移或干扰问题呢？建议一方面实验中进行加标回收来进行评价验证，另一方面采用DAD光谱图来识别是否可能存在干扰。建议不要为提高检验效率而使用短色谱柱，最好使用长一点的色谱柱。最为关键的是要识别出有干扰或漏判情况，如确实出现干扰，可加大水相比例，也可通过更换不同色谱柱，或采用不同方法（如气相色谱法）进行交叉验证。如发现基质中有干扰，且出现系统性情况，建议可通过光谱吸收情况采用标准品进行筛选验证，也可采用质谱进一步确证，关键是要找出可能的干扰信息，避免出现系统性风险。
结果判定注意问题
　　GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定，DHA和DHA-S可用于黄油和浓缩黄油、腌渍的蔬菜、腌渍的食用菌和藻类、发酵豆制品、淀粉制品、面包、糕点、焙烤食品馅料及表面用挂浆、预制肉制品、熟肉制品、复合调味料、果蔬汁（浆）共12类食品中，其最大允许使用量为1.0g/kg（DHA）计。判定时要注意GB 2760的一些基本原则，如食品分类（淀粉制品和米粉制品的区别等）、防腐剂比例之和、带入、新增补通告、表A.3等。目前允许使用脱氢乙酸的品种也可能是其他不得使用品种的带入分析对象，在监督抽检判定时要注意查看产品配料，是否含有如腌渍的蔬菜、腌渍的食用菌、复合调味料等配料。另外，要特别提醒食品行业的是，2021年3月发布的GB 2760修正版征求意见稿，对脱氢乙酸钠作出了非常大的压缩使用范围的调整，尤其涉及面包、糕点、肉制品、淀粉制品等行业，需要做好工艺改进的储备和适应。

□四川省食品检验研究院　余晓琴